"Jo Sahabat Sejati" menceritakan tentang Jo, kuda milik Arif (Ismu Tanjung), seorang guru, merupakan kuda kesayangan Arif dan adiknya Lisa (Amanda Latief). Selain Arif dan Lisa, Jo juga bersahabat dengan tiga murid Arif: Genta (Cornel Nadeak), Cinta (Novika Siregar) dan Danar (Adry Wicaksono). Persahabatan terjalin sejak Jo berhasil menyelamatkan tiga sekawan dari suatu kejadian.

Masyarakat kampung juga menyayangi Jo, karena Jo pintar dan suka menolong. Namun, peristiwa yang datang secara bertubi-tubi membuat Jo berada di posisi yang salah dan membuat Jo dibenci. Jo juga dituduh menjadi penyebab segala peristiwa yang terjadi. Karena hal itulah kemudian Jo diusir dari kampung dan terpisah dari para sahabatnya. Jo masih berharap bisa kembali lagi.